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第二法 分光光度法

8 原理

亞硝酸鹽采用鹽酸萘乙二胺法測定，硝酸鹽采用鎘柱還原法測定。

試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，在弱酸條件下亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，外標(biāo)法測得亞硝酸鹽含量。采用鎘柱將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，測得亞硝酸鹽總量，由此總量減去亞硝酸鹽含量，即得試樣中硝酸鹽含量。

9 試劑和材料

除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純。水為GB/T 6682 規(guī)定的二級(jí)水或去離子水。

9.1 亞鐵qinhuajia（K4Fe(CN)6·3H2O）。

9.2 乙酸鋅（Zn(CH3COO)2·2H2O）。

9.3 冰醋酸（CH3COOH）。

9.4 硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）。

9.5 鹽酸（ρ＝1.19 g/mL）。

9.6 氨水（25 %）。

9.7 對(duì)氨基苯磺酸(C6H7NO3S）。

9.8 鹽酸萘乙二胺(C12H14N2·2HCl）。

9.9 亞硝酸鈉（NaNO2）。

9.10 硝酸鈉（NaNO3）。

9.11 鋅皮或鋅棒。

9.12 硫酸鎘。

9.13 亞鐵qinhuajia溶液(106 g/L)：稱取106.0 g 亞鐵qinhuajia（9.1），用水溶解，并稀釋至1000 mL。

9.14 乙酸鋅溶液(220 g/L)： 稱取220.0 g 乙酸鋅（9.2），先加30 mL 冰醋酸（9.3）溶解，用水稀釋至1000 mL。

9.15 飽和硼砂溶液(50 g/L)： 稱取5.0 g 硼酸鈉（9.4），溶于100 mL 熱水中，冷卻后備用。

9.16 氨緩沖溶液（pH 9.6～9.7）：量取30 mL 鹽酸（9.5），加100 mL 水，混勻后加65 mL 氨水（9.6），再加水稀釋至1000 mL，混勻。調(diào)節(jié)pH 至9.6～9.7。

9.17 氨緩沖液的稀釋液：量取50 mL 氨緩沖溶液（9.16），加水稀釋至500 mL，混勻。

9.18 鹽酸(0.1 mol/L)： 量取5 mL 鹽酸，用水稀釋至600 mL。

9.19 對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g/L）：稱取0.4ｇ對(duì)氨基苯磺酸（9.7），溶于100 mL 20 %（V/V）鹽酸中，置棕色瓶中混勻，避光保存。

9.20 鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L）：稱取0.2 g 鹽酸萘乙二胺（9.8），溶于100 mL 水中, 混勻后，置棕色瓶中，避光保存。

9.21 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg /mL）：準(zhǔn)確稱取0.1000ｇ于110℃～120℃干燥恒重的亞硝酸鈉，加水溶解移入 500 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。

9.22 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.0 μg/mL）：臨用前，吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL，置于200 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度。

9.23 硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL，以亞硝酸鈉計(jì)）：準(zhǔn)確稱取0.1232 g 于110 ℃～120 ℃干燥恒重的硝酸鈉，加水溶解，移于入 500 mL 容量瓶中，并稀釋至刻度。

9.24 硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5 μg/mL）：臨用時(shí)吸取硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液2.50 mL，置于100 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度。

10 儀器和設(shè)備

10.1 天平：感量為0.1 mg 和1 mg。

10.2 組織搗碎機(jī)。

10.3 超聲波清洗器。

10.4 恒溫干燥箱。

10.5 分光光度計(jì)。

10.6 鎘柱

10.6.1 海綿狀鎘的制備：投入足夠的鋅皮或鋅棒于 500 mL 硫酸鎘溶液(200 g/L)中，經(jīng)過3 h～4 h，當(dāng)其中的鎘全部被鋅置換后，用玻璃棒輕輕刮下，取出殘余鋅棒，使鎘沉底，傾去上層清液，以水用傾瀉法多次洗滌，然后移入組織搗碎機(jī)中，加500 mL 水，搗碎約2 s，用水將金屬細(xì)粒洗至標(biāo)準(zhǔn)篩上，取20 目～40 目之間的部分。

10.6.2 鎘柱的裝填：如圖2。用水裝滿鎘柱玻璃管，并裝入2 cm 高的玻璃棉做墊，將玻璃棉壓向柱底時(shí)，應(yīng)將其中所包含的空氣全部排出，在輕輕敲擊下加入海綿狀鎘至8 cm～10 cm 高，上面用1 cm 高的玻璃棉覆蓋，上置一貯液漏斗，末端要穿過橡皮塞與鎘柱玻璃管緊密連接。如無上述鎘柱玻璃管時(shí)，可以25 mL 酸式滴定管代用，但過柱時(shí)要注意始終保持液面在鎘層之上。當(dāng)鎘柱填裝好后，先用25 mL 鹽酸(0.1 mol/L)洗滌，再以水洗兩次，每次25 mL，鎘柱不用時(shí)用水封蓋，隨時(shí)都要保持水平面在鎘層之上，不得使鎘層夾有氣泡。

10.6.3 鎘柱每次使用完畢后，應(yīng)先以25 mL 鹽酸（0.1 mol/L）洗滌，再以水洗兩次，每次25 mL，zui后用水覆蓋鎘柱。

10.6.4 鎘柱還原效率的測定：吸取20 mL 硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，加入5 mL 氨緩沖液的稀釋液，混勻后注入貯液漏斗，使流經(jīng)鎘柱還原，以原燒杯收集流出液，當(dāng)貯液漏斗中的樣液流完后，再加5 mL 水置換柱內(nèi)留存的樣液。取10.0 mL 還原后的溶液（相當(dāng)10 μg 亞硝酸鈉）于50 mL 比色管中，以下按11.4自“吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80mL、1.00mL……”起依法操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測得結(jié)果，與加入量一致，還原效率應(yīng)大于98%為符合要求。

10.6.5 還原效率計(jì)算

還原效率按式（2）進(jìn)行計(jì)算。

% …………………………………………………………（2）

式中：

X——還原效率，%；

A——測得亞硝酸鈉的含量，單位為微克（μg）；

10——測定用溶液相當(dāng)亞硝酸鈉的含量，單位為微克（μg）。

11 分析步驟

11.1 試樣的預(yù)處理

同5.1。

11.2 提取

稱取5ｇ（至0.01 g）制成勻漿的試樣（如制備過程中加水，應(yīng)按加水量折算），置于50 mL

燒杯中，加12.5 mL 飽和硼砂溶液（9.15），攪拌均勻，以70 ℃左右的水約300 mL 將試樣洗入 500 mL

容量瓶中，于沸水浴中加熱 15 min，取出置冷水浴中冷卻，并放置至室溫。

11.3 提取液凈化

在振蕩上述提取液時(shí)加入5 mL 亞鐵qinhuajia溶液（9.13）, 搖勻, 再加入 5 mL 乙酸鋅溶液（9.14）,以沉淀蛋白質(zhì)。加水至刻度, 搖勻, 放置30 min, 除去上層脂肪, 上清液用濾紙過濾, 棄去初濾液30 mL,濾液備用。

11.4 亞硝酸鹽的測定

吸取40.0 mL 上述濾液于50 mL 帶塞比色管中，另吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（相當(dāng)于0.0 μｇ、1.0 μｇ、2.0 μｇ、3.0 μｇ、4.0 μｇ、5.0 μｇ、7.5 μｇ、10.0 μｇ、12.5 μｇ亞硝酸鈉），分別置于50 mL 帶塞比色管中。于標(biāo)準(zhǔn)管與試樣管中分別加入2 mL 對(duì)氨基苯磺酸溶液（9.19），混勻，靜置3 min～5 min 后各加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液(9.20)，加水至刻度，混勻，靜置15 min，用2 cm 比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長 538 nm 處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。同時(shí)做試劑空白。

11.5 硝酸鹽的測定

11.5.1 鎘柱還原

11.5.1.1先以 25 mL 稀氨緩沖液（9.17）沖洗鎘柱，流速控制在3 mL/min～5 mL/min（以滴定管代替的可控制在2 mL/min～3 mL/min）。

11.5.1.2吸取 20 mL 濾液于50 mL 燒杯中，加5 mL 氨緩沖溶液（9.16），混合后注入貯液漏斗，使流經(jīng)鎘柱還原，以原燒杯收集流出液，當(dāng)貯液漏斗中的樣液流盡后，再加5 mL 水置換柱內(nèi)留存的樣液。

11.5.1.3將全部收集液如前再經(jīng)鎘柱還原一次，第二次流出液收集于100 mL 容量瓶中，繼以水流經(jīng)鎘柱洗滌三次，每次20 mL，洗液一并收集于同一容量瓶中，加水至刻度，混勻。

11.5.2 亞硝酸鈉總量的測定

吸取10 mL～20 mL 還原后的樣液于50 mL 比色管中。以下按11.4 自“吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL……”起依法操作。

12 分析結(jié)果的表述

12.1 亞硝酸鹽含量計(jì)算

亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計(jì)）的含量按式（3）進(jìn)行計(jì)算。

……………………………………………………（3）

式中：

X1——試樣中亞硝酸鈉的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

A1——測定用樣液中亞硝酸鈉的質(zhì)量，單位為微克（μg）；

m——試樣質(zhì)量，單位為克（ｇ）；

V1——測定用樣液體積，單位為毫升（mL）；

V0 ——試樣處理液總體積，單位為毫升（mL）。

以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

12.2 硝酸鹽含量的計(jì)算

硝酸鹽（以硝酸鈉計(jì)）的含量按式（4）進(jìn)行計(jì)算。

……………………………（4）

式中：

X2——試樣中硝酸鈉的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

A2——經(jīng)鎘粉還原后測得總亞硝酸鈉的質(zhì)量，單位為微克（μg）；

m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

1.232——亞硝酸鈉換算成硝酸鈉的系數(shù)；

V2——測總亞硝酸鈉的測定用樣液體積，單位為毫升（mL）；

V0——試樣處理液總體積，單位為毫升（mL）；

V3——經(jīng)鎘柱還原后樣液總體積，單位為毫升（mL）；

V4——經(jīng)鎘柱還原后樣液的測定用體積，單位為毫升（mL）；

X1——由式（3）計(jì)算出的試樣中亞硝酸鈉的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）。

以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

13 精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的差值不得超過算術(shù)平均值的10 %。