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瓊脂擴(kuò)散法是測(cè)定抗菌物質(zhì)效價(jià)常用的方法，但人為操作因素常常影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)旨在 建立一種測(cè)定準(zhǔn)確、操作簡單、無需特殊設(shè)備的分光光度計(jì)比濁法來測(cè)定各種抗菌物質(zhì)的效價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)，以抑 菌率高時(shí)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間為取樣時(shí)間點(diǎn)，在中等接種量下，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，細(xì)菌素 nisin、類細(xì)菌素 NFL 和 抗生素硫酸慶大霉素這 3 種抗菌物質(zhì)的濃度與抑菌率之間的線性關(guān)系良好，Ｒ2 值均高于 0. 99，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。 該法適用于設(shè)備條件簡單的實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確測(cè)定各類抗菌物質(zhì)效價(jià)。

抗菌物質(zhì)是指具有殺菌或抑菌活性的物質(zhì)，包括 細(xì)菌素、類細(xì)菌素和抗生素等生物活性物質(zhì)。在過去 的 60 多年里，多種能準(zhǔn)確測(cè)定抗菌物質(zhì)活性的方法 先后被提出，包括 ATP 生物發(fā)光測(cè)定法( ATP Bioluminometry) 、綠色熒光蛋白測(cè)定法( GFP bioassay) 、 MTT［3-( 4，5-dimethyl thiazol-2-yl) -2，5-diphenyl tetrazolium bromide］比色法、免疫學(xué)方法等 ［1 － 4］，然而 使用這些方法需要特殊的試劑或儀器設(shè)備，因此沒有 得到廣泛應(yīng)用。長期以來，瓊脂擴(kuò)散法( agar diffusion assay) 因無需特殊材料，檢測(cè)成本低［5 － 6］而成為測(cè)定 抗菌物質(zhì)活性常用的方法，但是該法耗時(shí)耗力、對(duì) 操作人員經(jīng)驗(yàn)要求高、人為影響因素多，實(shí)驗(yàn)者經(jīng)常 得不到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［7］。1952 年，Berridge 和 Barrett 應(yīng)用微孔比濁法來測(cè)定抗生素效價(jià)［8］，經(jīng)過 幾十年的不斷改進(jìn)，該法已以成為可以定量測(cè)定抗菌 物質(zhì)的一種方法［9 － 10］，但是，需要使用酶標(biāo)儀這一 “短板”限制了其廣泛應(yīng)用，如能建立起分光光度計(jì) 比濁法無疑將極大提高其應(yīng)用普遍性。為此本研究 對(duì)于影響分光光度計(jì)比濁法準(zhǔn)確定量抗菌物質(zhì)效價(jià) 的關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究，建立了測(cè)定細(xì)菌素 nisin、類 細(xì)菌素 NFL［11］和抗生素硫酸慶大霉素等抗菌物質(zhì)效 價(jià)的分光光度計(jì)比濁法。

1 材料與方法

1. 1. 1 菌種 金黃桿菌( Chryseobacterium) NHW 菌株、乳酸乳 球菌( Lactococcus lactis) NFL 菌株和乳酸乳球菌( L. lactis) 8148 菌株，為安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn) 室保藏。 1. 1. 2 培養(yǎng)基 STAA 培 養(yǎng) 基: 蛋 白 胨 20 g，酵 母 抽 提 物 2 g， K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，甘油 15 g，瓊脂 13 g， 蒸餾水 1 000 mL，pH 7. 0 ± 0. 2，121 ℃下 15 min 滅菌 后冷卻至 40 ～ 50 ℃ 左右，加入過濾除菌的鏈霉素 500 mg，環(huán)己六亞胺 50 mg 和乙酸鹽 50 mg 混勻，用 于培養(yǎng)金黃桿菌 NHW 菌株。 MＲS 培養(yǎng)基: 牛肉浸膏 8. 0 g，Tween-80 1. 0 mL， 葡萄糖 20. 0 g，胰蛋白胨 10. 0 g，酵母抽提物 4. 0 g， K2HPO4 2. 0 g，檸檬酸三銨 2. 0 g，醋酸鈉 5. 0 g，MnSO4·H2O 0. 05 g，MgSO4·7H2O 0. 2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6. 0 ± 0. 2。用于培養(yǎng)乳酸乳球菌 NFL 菌株。 GM17 培養(yǎng)基: 補(bǔ)充了 15 g /L 葡萄糖的 M17 培 養(yǎng)基( 購自青島海博) ，用于培養(yǎng)乳酸乳球菌 8148 菌 株。 1. 2 實(shí)驗(yàn)方法 1. 2. 1 抗菌物質(zhì)抗菌類型的確定 乳酸乳球菌 NFL 發(fā)酵上清液的制備: 將活化后 的乳酸乳球菌 NFL 菌株以 5% 接種量接種于 MＲS 液 體培養(yǎng)基中，30 ℃ 培養(yǎng) 12 h，離心( 10 000 r /min，15 min) 取上清液，將上清液過濾除菌，取濾液備用。 硫酸慶大霉素、氯霉素和類細(xì)菌素 NFL 抗菌類 型的確定: 將活化后的指示菌金黃桿菌 NHW 菌株以 5% 接種量接種于 STAA 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心( 10 000 r /min，5 min) 取菌體，用生理鹽水洗 滌 1 次，將菌體重懸于生理鹽水中，分別添加終質(zhì)量 濃度為 16. 67 μg /mL 的氯霉素乙醇溶液、888. 89 U / mL 的硫酸慶大霉素水溶液、66. 67 μL /mL 的 NFL 菌 上清液，30 ℃下振蕩 ( 150 r /min) 培養(yǎng) 6 h，分別在 培養(yǎng)的 0 時(shí)刻和 6 h 取 200 μL 發(fā)酵液涂布于 STAA 平板表面，30 ℃下培養(yǎng)測(cè)定菌落總數(shù)。 nisin 抗菌類型的確定: 將活化后的指示菌乳酸 乳球菌 8148 菌株以 5% 接種量接種于 GM17 液體培 養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心( 10 000 r /min，5 min) 取 菌體，用生理鹽水洗滌 1 次，將菌體重懸于生理鹽水 中，添加終濃度為 1. 5 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液( 0. 02 mol /L) 。30 ℃下靜置培養(yǎng) 6 h，分別在培養(yǎng)的 0 h 和 6 h 取 200 μL 發(fā)酵液涂布于 GM17 平板表面，30 ℃ 下培養(yǎng)測(cè)定菌落總數(shù)。 1. 2. 2 不同抗菌物質(zhì)抑菌率曲線的測(cè)定 將活化后的指示菌以 2% 的接種量接種于相應(yīng) 的培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組分別加入終質(zhì)量濃度為 16. 67 μg /mL 的氯霉素乙醇溶液 ( 對(duì)照為無水乙醇) 、 888. 89 U /mL 的硫酸慶大霉素水溶液( 對(duì)照為無菌 水) 、66. 67 μL /mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上清液( 對(duì)照為 MＲS 培養(yǎng)基) 和 0. 5 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液( 對(duì)照為 0. 02 mol /L HCl 溶液) ，培養(yǎng)過程中每隔 2 h 取樣，立 即轉(zhuǎn)入冰水浴中以終止微生物生長，于 600 nm 波長 處測(cè)定吸光值( 上海奧析，UV1800紫外可見分光光度 計(jì)) ，連續(xù)測(cè)定至 14 h。對(duì)照組加入量與實(shí)驗(yàn)組體積 相同，其余方法同實(shí)驗(yàn)組。 抑菌率/% = ( OD對(duì)照 － OD實(shí)驗(yàn)) /OD對(duì)照 × 100 1. 2. 3 抗菌物質(zhì)效價(jià)分光光度計(jì)比濁法的建立 1. 2. 3. 1 指示菌接種量對(duì)取樣時(shí)間點(diǎn)的影響 乳酸乳球菌 8148 接種量對(duì) nisin 效價(jià)測(cè)定取樣 時(shí)間點(diǎn)的影響: 將活化后的乳酸乳球菌 8148 菌株分 別以 2% 、5% 、8% 的接種量接入 GM17 培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn) 組中加入終濃度為0. 5 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液，分別 在 30 ℃下靜置培養(yǎng) 1、2、3 h，取樣，測(cè)定抑菌率和發(fā) 酵液濁度增量，濁度增量 OD600 = OD600實(shí)驗(yàn) － OD600起始。 金黃桿菌 NHW 接種量對(duì)類細(xì)菌素 NFL 效價(jià)測(cè) 定取樣時(shí)間點(diǎn)的影響: 將活化后的金黃桿菌 NHW 分 別以 1% 、2% 、3% 的接種量接入 STAA 培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn) 組中加入終濃度為 66. 67 μL /mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上 清液，分別在 30 ℃下振蕩培養(yǎng) 3、4、5 h 取樣，測(cè)定抑 菌率和發(fā)酵液濁度增量 OD600。 1. 2. 3. 2 測(cè)定抗菌物質(zhì)效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立nisin 效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立: 將活化后的乳酸乳 球菌 8148 菌株以 5% 的接種量接入 GM17 培養(yǎng)基，實(shí) 驗(yàn)組中加入終濃度為 0. 2、0. 5、0. 8、1. 1、1. 4 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液，在 30 ℃下靜置培養(yǎng) 2 h，取樣測(cè)定 抑菌率。另一實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為 0. 4、0. 8、1. 2、 1. 6、2. 0、2. 4 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液，在 30 ℃ 下靜 置培養(yǎng) 5 h，取樣測(cè)定抑菌率。 2 h 取樣的 nisin 效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn): 將 活化后的乳酸乳球菌 8148 菌株以 5% 的接種量接入 GM17 培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為 0. 4、1. 0 U / mL 的 nisin 鹽酸溶液，在 30 ℃ 下靜置培養(yǎng) 2 h，取樣 測(cè)定抑菌率。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算這兩個(gè) 樣品的測(cè)定誤差率( ＲSD) 。 ＲSD/% = 抑菌率( 實(shí)際) － 抑菌率( 擬合) 抑菌率( 實(shí)際) × 100 類細(xì)菌素 NFL 效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立: 將活化后 的金黃桿菌 NHW 以 2% 的接種量接入 STAA 培養(yǎng) 基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為 36. 67、43. 33、50. 00、 56. 67、63. 33 μL /mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上清液，分別 在 30 ℃下振蕩培養(yǎng) 4 h，取樣測(cè)定抑菌率。測(cè)定終濃 度為 40、60 μL /mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上清液的抑菌 率，用所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算這兩個(gè)樣品的測(cè) 定誤差率( ＲSD) 。 硫酸慶大霉素效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立: 將活化后的 金黃桿菌 NHW 菌株以 2% 的接種量接入 STAA 培養(yǎng) 基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為 444. 44、533. 33、622. 22、 711. 10、799. 99、888. 88 U /mL 的硫酸慶大霉素水溶 液，分別在 30 ℃ 下振蕩培養(yǎng) 4 h，取樣測(cè)定抑菌率。 測(cè)定終濃度為 577. 77、755. 55 U /mL 的硫酸慶大霉 素水溶液的抑菌率，用所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算 這兩個(gè)樣品的測(cè)定誤差率( ＲSD) 。 2 結(jié)果與分析 2. 1 不同抗菌物質(zhì)的抑菌率曲線 從圖 1 可以看出，隨著指示菌在硫酸慶大霉素水 溶液中處理時(shí)間的延長，細(xì)胞逐步被殺死，失去生長 能力。而指示菌在 nisin、氯霉素和 NFL 菌株發(fā)酵上 清液中處理 6 h，活菌數(shù)下降幅度均很小，nisin 和氯 霉素是已知的抑菌劑，表明 NFL 菌株發(fā)酵上清液具 抑菌活性而非殺菌活性。 在指示菌培養(yǎng)基中分別添加以上各種抗菌劑 后，測(cè)定其生長曲線，計(jì)算得到抑菌率曲線。從圖 2 可見，抑菌類抗菌劑 nisin、氯霉素和 NFL 菌株發(fā)酵上

2 抗菌物質(zhì)效價(jià)分光光度計(jì)比濁法的建立 2. 1 接種量對(duì)取樣時(shí)間點(diǎn)的影響 抑菌率計(jì)算的依據(jù)是生物量，而接種量的大小會(huì) 直接影響微生物細(xì)胞生物量的高低，因此研究了指示 菌接種量對(duì)取樣時(shí)間點(diǎn)的影響。從圖 3 可以看 出，中等( 5% ) 和較高( 8% ) 接種量下測(cè)定 nisin 濃度 的取樣時(shí)間點(diǎn)均為 2 h。低接種量( 2% ) 下，指 示菌培養(yǎng) 3 h 的抑菌率高于 2 h 的，導(dǎo)致測(cè)定 nisin 濃 度的取樣時(shí)間點(diǎn)延后。取樣時(shí)間點(diǎn)的確定 不僅取決于高抑菌率，還要兼顧指示菌生長增量和 培養(yǎng)時(shí)間，如圖 3 所示，低接種量( 2% ) 下指示菌培 養(yǎng) 3h 的 對(duì) 照 組 ( 未 添 加 nisin ) 發(fā)酵液濁度增量 ( OD600 ) 很低，表明此時(shí)體系中的活菌量較低，不能很 好地表征 nisin 的抑菌效力，且培養(yǎng)時(shí)間偏長。因此， 以乳酸乳球菌 8148 為指示菌來測(cè)定 nisin 濃度指示菌接種量為 5% ，取樣時(shí)間點(diǎn)為 2 h。

2. 2 分光光度計(jì)比濁法測(cè)定抗菌物質(zhì)效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲 線的建立 2. 2. 1 測(cè)定 nisin 效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以 5% 接種量接種指示菌乳酸乳球菌 8148，在 GM17 培養(yǎng)基中添加不同終濃度的 nisin，培養(yǎng) 2 h，測(cè) 定抑菌率，以抑菌率對(duì) nisin 濃度值進(jìn)行線性回歸。 由圖 5 可知，在 nisin 終濃度為 0. 2 ～ 1. 4 U /mL，抑菌 率為 25% ～ 98% 的范圍內(nèi)，nisin 濃度與抑菌率之間 呈良好的線性關(guān)系( Ｒ2 = 0. 9921) ，驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)( 表 1) 表明，該方法的準(zhǔn)確度較高( ＲSD ＜ 5% ) 。在非取樣時(shí)間點(diǎn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的 Ｒ2 值低于 0. 99，表明此時(shí)取樣測(cè)定所得數(shù)據(jù)的線性相關(guān)度偏
 

2. 2. 2 測(cè)定類細(xì)菌素 NFL 效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 乳酸乳球菌 NFL 菌株發(fā)酵上清液中含有類細(xì)菌 素 NFL，與 nisin 不同，NFL 菌株發(fā)酵上清液不是純 品，其中還含有未被細(xì)胞利用完的營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn) 物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本比濁法同樣適用于發(fā)酵液中抑菌物 質(zhì)活性的定量測(cè)定。以 2% 接種量接種指示菌金黃 桿菌 NHW 菌株，在 STAA 培養(yǎng)基中添加不同體積的 NFL 菌株發(fā)酵上清液，培養(yǎng) 4 h，測(cè)定抑菌率，以抑菌 率對(duì) NFL 菌株發(fā)酵上清液添加量進(jìn)行線性回歸。由 圖 6 可知，在 NFL 菌株發(fā)酵上清液添加量為 36 ～ 64 μL /mL，抑菌率為 7% ～ 58% 的范圍內(nèi)，發(fā)酵上清液 添加量與抑菌率之間的線性相關(guān)良好( Ｒ2 = 0. 994) ， 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)( 表 2) 表明該方法的準(zhǔn)確度較高( ＲSD ＜ 5% ) 。

2. 2. 3 測(cè)定硫酸慶大霉素效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 由圖 7 可知，nisin 測(cè)定取樣時(shí)間點(diǎn)( 2 h) 所 對(duì)應(yīng)的時(shí)刻是實(shí)驗(yàn)組( 培養(yǎng)基中含 0. 5 U /mL 的 nisin) 生長曲線的對(duì)數(shù)前期。如前所述，硫酸慶大霉素 的抑菌率曲線與 nisin 等抑菌劑的不同，并沒有呈現(xiàn) 明顯的峰值，但在 4 h 時(shí)抑菌率會(huì)處于一直較高的平 臺(tái)，此時(shí)對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組也基本處于對(duì)數(shù)前期。

3 討論 采用比濁法測(cè)定抗菌物質(zhì)特別是抗生素效價(jià)的 文獻(xiàn)不少，方法大致都是將抗菌物質(zhì)加入指示菌培養(yǎng) 體系中培養(yǎng)一段時(shí)間( 一般為 2 ～ 5h) 測(cè)定濁度，抗菌 物質(zhì)濃度的對(duì)數(shù)與濁度在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 ( Ｒ2 ＞ 0. 99) ［12 － 14］。但這些報(bào)道中均沒有說明抗菌 物質(zhì)與指示菌培養(yǎng)時(shí)間( 即取樣測(cè)定濁度的時(shí)間點(diǎn)) 的確切依據(jù)。李秀蘭等采用分光度度計(jì)比濁法測(cè)定 抗菌肽活性，抗菌肽濃度與活力單位之間線性關(guān)系良 好，但是操作較為復(fù)雜，需要將對(duì)數(shù)期的指示菌菌體 洗滌后重懸于緩沖液中，加入抗菌肽樣品振蕩培養(yǎng) 30 min 后測(cè)定濁度，將所測(cè)結(jié)果代入經(jīng)驗(yàn)公式得到活 力單位［15］。同樣，作者也沒有說明為何要培養(yǎng) 30 min，這樣對(duì)于其他種類抗菌物質(zhì)效價(jià)的測(cè)定，并不具 有直接的借鑒意義。 本研究所建立的比濁法是將抑菌率與抗菌物質(zhì) 濃度之間直接建立線性相關(guān)，并且找到了抑菌劑和抗 菌劑效價(jià)線性定量測(cè)定的關(guān)鍵因子，即取樣時(shí)間點(diǎn)。 以 nisin 和硫酸慶大霉素的效價(jià)測(cè)定為例( 圖 5 和圖 9) ，如果取樣時(shí)間點(diǎn)選擇得不好，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線 Ｒ2 值就會(huì)小于 0. 99，達(dá)不到線性相關(guān)的要求。無論是 nisin 這種抑菌劑還是硫酸慶大霉素這種殺菌劑，取樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的都是實(shí)驗(yàn)組( 即培養(yǎng)基中加入 抗菌物質(zhì)) 生長曲線的對(duì)數(shù)前期( 圖 7 和圖 8) ，這種 規(guī)律性可能是因?yàn)楸痉ú捎玫囊志手笜?biāo)依據(jù)的是 對(duì)照組活細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)組中未被抑制或殺死的活細(xì)胞 生長能力的比較，當(dāng)取樣時(shí)間點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)組的對(duì)數(shù)前 期，實(shí)驗(yàn)組生物量基本可以反映當(dāng)時(shí)的活細(xì)胞數(shù); 如 果取樣時(shí)間點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)組的對(duì)數(shù)末期，實(shí)驗(yàn)組生物量會(huì) 包含部分死細(xì)胞，就會(huì)偏離效價(jià)與抑菌率之間的線性 相關(guān)了。 除此之外，接種量的大小對(duì)抑菌率的高低有顯著 的影響( 圖 3 和圖 4) ，雖然低接種量下高抑菌率值 較高，但取樣時(shí)間點(diǎn)會(huì)延后，且指示菌生長速度 偏低，并不能很好地表現(xiàn)出抑菌物質(zhì)的作用; 高接種 量從檢測(cè)時(shí)間和高抑菌率方面均較差，因此，接種 量的優(yōu)化對(duì)于提高本方法的應(yīng)用效果十分必要。 本研究所建立的分光光度計(jì)比濁法不僅可用來 準(zhǔn)確測(cè)定 nisin、類細(xì)菌素 NFL 和慶大霉素的效價(jià)，而 且具有設(shè)備簡單、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。有理由相信，本 方法也可以適用于其他抗菌物質(zhì)效價(jià)的測(cè)定。首先， 測(cè)定抗菌物質(zhì)抑菌率曲線，以此為依據(jù)，抑菌劑以 高抑菌率對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)為取樣時(shí)間點(diǎn)，殺菌劑可以結(jié) 合實(shí)驗(yàn)組生長曲線和抑菌率曲線，綜合考慮實(shí)驗(yàn)組對(duì) 數(shù)前期和抑菌率峰值選擇出合適的取樣時(shí)間點(diǎn); 隨 后，測(cè)定指示菌不同接種量下的抑菌率，確定合適的 指示菌接種量; 后，建立抑菌率與抗菌物質(zhì)效價(jià)之 間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。